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Refugebio:利用别样CRISPR技术,瑞士军刀式开发新细胞疗法
边士娟·2018-03-13
边研
与此前出现的各种基因改造手段相似,由于CRISPR技术可以一次性永久改变DNA携带的信息,在技术风险控制和伦理风险双层角度都面临着挑战


撰文 | 边士娟 

Bsj0421@126.com

责编 | 戴佳凌

Dai.Jialing@PharmaDJ.com 


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丢失魔剪天赋的CRISPR干扰与激活系统


----突变CRISPR系统中常用的Cas9蛋白可使其失去基因切割功能(dCas9),改造剪刀手CRISPR为转录控制工具CRISPRi/a


----局限在转录层面“做文章”,绕开经典的CRISPR“基因改写”思路


时光如梭,距离CRISPR技术最初走红生物学界已经过去五六年时间。CRISPR基因编辑技术让细胞工程学和疾病基础研究呈现着日新月异的推进速度,持续在深度和广度上刷新着我们对这一基因“剪刀手”的认知。

 

在CRISPR系统逐渐普及的同时,研究者们一直在对工具本身进行优化。本文以上下篇的格局分别讲述CRISPRi/a技术,以及一家专注开发这项技术、在硅谷成长起来的初创公司Refuge Biotech。

 

CRISPR技术缔造了广阔的梦工厂,Refuge利用的是别具匠心改造后的CRISPR interference/CRSIPR activation(CRISPRi/a)系统,结合受体激活的细胞工程技术,以带有未来色彩的瑞士军刀式平台探索多层优化的细胞疗法。下篇我们将详解Refuge团队具有传奇色彩的项目。

 

目前最常使用的II类CRISPR系统,是在细胞内引入Cas9蛋白和向导RNA(gRNA)两个组分,依靠gRNA的精确识别,利用具有核酸酶功能的Cas9蛋白对所定位到的特定序列DNA进行切割,从而为特定基因的失活、修正或基因的引入提供关键一步。然而,这种硬性干预可能永久改变细胞甚至后代细胞的命运,并非所有调控细胞的需求都可诉诸于经典CRISPR技术。另外尽管脱靶编辑的风险已随技术进步变得越来越可控,但在人体内的脱靶概率是否微弱到足以忽略仍是待解之题。

 

科学研究常常具有辩证的思考倾向。CRISPR系统能否避免永久编辑,仅短期改变细胞的功能状态就成为了一部分研究者的探索方向。其中之一是Refuge团队所耕耘的方向:变基因编辑工具为基因调控新平台的CRISPRi/a技术。Refuge的共同创始人之一,核心科学家Stanley Qi博士曾与Jennifer Doudna等人一同发表了最早应用CRISPRi/a的研究,文章探索了对细胞内特定基因表达的调控【1】。

 

作为一个前沿的开发领域,CRISPRi/a技术的应用显著区别于传统CRISPR/Cas9系统。

 

CRISPRi/a工具的关键不同首先在于dCas9,即通过引入突变使Cas9失去DNA切割功能,成为dead Cas9,但仍然具有依赖于gRNA的DNA结合活性。同时CRISPRi/a中的gRNA精准定位DNA靶序列的功能依然不变。

 

最初Stanley Qi等人的CRISPRi研究仅仅通过失活的dCas9结合到靶序列来干扰RNA聚合酶的结合或移动,从而降低DNA转录水平。在离体的人类细胞内,这一简单系统仅能将转录水平降低一半【1】。但令人惊喜的是,他们很快尝试使用了可以进一步在真核细胞内显著提升调控效果的附加组分:将dCas9蛋白基因与其他可影响基因转录的元件融合。这些元件可以帮助招募调节基因表达的复合物,从而比单纯dCas9可以更有效地激活或抑制转录,Stanley Qi等科学家在2013年的研究结果发现,在酿酒酵母(S.cerevisiae)和人类子宫颈癌细胞系(Hela细胞系)中可以达到较基线转录水平几倍到几十倍的激活或抑制效果【2】。

 

当然,CRISPRi/a方法并不是唯一的特异性转录干预手段。比如,CRISPRi与一些RNA干扰疗法在抑制基因表达的作用上具有异曲同工的效果。但CRISPRi能在大多数情况下更高效地实现RNA干扰疗法的目的,而且可以更便捷地针对多个基因进行调控。另外,CRISPRa技术直接上调基因表达的机制也是RNA干扰技术不能实现的。


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走在细胞编程技术前沿的Refugebio


----配体激活下启动一到多种转录激活或抑制功能,让改造的T细胞具备决策机制


----选择恰当的细胞表面受体与dCas9元件携手,“瑞士军刀”思路整合多疗法功用

 

目前肿瘤免疫疗法的研发格局和趋势值得反思,在实现不少历史性突破的同时也遇到了新的局限。CAR-T疗法获批,在血液瘤患者中捷报频传,但对实体瘤却疗效有限;免疫检查点抑制剂给实体瘤患者带来希望,但大部分患者都无法实现最好的疗效。对于后者,解决方法之一是尝试联合其他肿瘤微环境及T细胞激活类新药,但叠加疗法的开发需要大量的试错过程和研发投入。

 

CRISPRi/a技术的基因调控作用对人类基因组各元件、各基因的研究具有直观且明确的意义,但拥有相关开发专利的Refuge Biotech公司在组建之日起就没有囿于基础研究。他们将目光早早投向了细胞疗法的疆域,更确切地说,是探索在细胞内引入条件激活的治疗性程序,尝试整合和便捷化现行肿瘤免疫疗法。

 

量子工程学研究出身、联合创始人兼CEO Wang Bing博士向我们介绍道,启发Refuge的细胞编程化思路的,是信息时代像智能手机这样设计精良的电子设备可提供的高度便捷性。“智能手机的工作方式其实给我们很多的提示。手机通过多种信号网络和外界沟通,我们可以通过触摸屏随时开启或关闭手机的功能,通过指纹识别激活手机,操作系统是手机的核心。这就像细胞的工作原理,通过GPCR这样的‘天线’感知外界环境的信号,通过TCR感知其他细胞的身份,而来自细胞DNA的控制则相当于手机操作系统的地位。我们这类公司想要解决的问题是如何对细胞实现计算级和编程级的工程优化,高度控制细胞的行为,创造更好的细胞疗法。这已经超越了CAR-T范畴的概念,超过了靶点开发的简单意义。” 

 

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肿瘤免疫治疗正在探索的抗体及涉及的基因

 

Refuge成立之初的故事不妨在这里一提。2015年5月,仍在投行任职的Bing对火热的CRISPR技术有所耳闻,找到在斯坦福生物工程系做副教授的Stanley Qi请教究竟,在酒吧畅聊3小时后,他们当即决定成立一个公司,把Stanley研究的特殊CRISPR技术致以实用。而这两位务实的创始人把酒吧的名字Refuge直接作为了成立的公司名字。Refuge 的名字也正好与公司的技术平台相吻合(Refuge = Receptor fusion gene editor)。2016年1月,JPM大会期间,Refugebio申请了第一项专利,与此同时Bing正式开始任职Refuge的CEO。Refuge的目标在于利用dCas9-CRISPR系统的转录调控作用,使dCas9在受体(比如CAR)激活的情况下再释放为自由状态,与gRNA结合共同启动转录调控,实现经典CAR-T和其他靶点类药物的联合治疗效果。

 

得益于硅谷创业文化进取的精神,以及同行在各技术模块的已有成果, 精简的Refuge团队正在逐步推进着他们的临床前项目。让我们以研发最深入的项目Refuge CAR-T CD19为例来简单分析一下Refuge看似复杂的技术平台。

 

相对于经典自体CAR-T疗法,Wang Bing博士指出了Refuge CAR-T CD19想要通过CRISPRi系统简化两个问题。首先是针对CD19 CAR-T治疗无效的淋巴瘤患者肿瘤细胞表达PD-L1分子,虽然CAR-T与PD1抗体的联合使用被寄予一定期望,但相关研究还处于早期阶段。另一个是患者出现CRS和神经系统毒性症状后的一个重要对策是及时应用IL-6抗体(Tocilizumab),从而拮抗体内过度活跃的免疫细胞与细胞因子作用。这两个因素都使得CAR-T治疗需要进一步完善。Refuge团队在这种组合疗法之外提供了另一种选择:借CRISPRi系统的调控作用,让CAR-T在遇到肿瘤抗原被激活的同时,启动PD-1和IL-6相关基因的转录调控,从而提高CAR-T疗法的有效性和安全性。

 

2.jpg Refugebio的第一个在研疗法设计:CD-19: PD-1-:IL-6

 

我们可以想见这种转录调节并不能持续、彻底地抑制T细胞内靶基因的功能,而且dCas9从CAR胞内段脱离后,联合gRNA调控转录不是一个瞬时的过程,其转录抑制效果可能需要数小时才能体现。对此,Wang Bing博士向我们介绍了Refuge团队设计的一项体外试验,主要对比经典CAR-T细胞与进一步工程化的Refuge CAR-T CD19的肿瘤杀伤力。试验发现,在接触肿瘤抗原后第一天Refuge CAR-T CD19和经典CD19 CAR-T的杀伤作用基本持平,第二天Refuge CAR-T CD19展现出较强的肿瘤细胞杀伤效果【3】。

 

3.jpg 

Refuge CD19 CAR-T 对比经典型CD19CAR-T细胞针对淋巴瘤细胞的杀伤能力 

 

Bing表示,Refuge团队接下来很快会开始在体内研究,初步验证装载有PD-1 gRNA和CAR结合型dCas9的CAR-T细胞在淋巴瘤动物模型中的抗肿瘤效果和生存期的获益。第二组调控组件IL-6 gRNA的引入也在平行开展中。

 

针对CD19的CAR-T已经是迄今研究最深入的CAR-T疗法,但Refugebio的另外一位联合创始人,曾任FDA生物药顾问委员会主席的David Parkinson博士则说服了Stanely Qi和Wang Bing仍以CD19为首发项目,因为以快捷方式优化的Refuge CD19 CAR-T如能成功推进,Refuge平台的价值将实现快速验证。更重要的是,CRISPRi技术带来的差异化优势将有机会转化为真正有意义的编程化细胞疗法。特别是条件激活和多管齐下的表达调控是他们的重要设计优势。至于如何较长时间维系T细胞内这些基因调控效果,临床前动物试验数据应该能提供一些线索。

 

Refuge的计划是在2020年递交Refuge CAR-T CD19的IND申请。他们计划利用现有平台继续在CAR-T治疗实体瘤领域广泛探索,即将开展的项目针对的是实体瘤的多个靶点,包括ERBB2/HER2,间皮素,MUC1。Refugebio希望瑞士军刀般的多方位优化思路可以让T细胞战士能化解当前的肿瘤治疗困境。这一思路未来是否能突破CAR-T在实体瘤方面的暗淡战绩,我们将拭目以待。


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结语

 

在CRISPR技术和CAR-T技术成为科研界和产业界点击率最高词汇的历史性时刻,也有不少的反思。与此前出现的各种基因改造手段相似,由于CRISPR技术可以一次性永久改变DNA携带的信息,在技术风险控制和伦理风险双层角度都面临着挑战,在人类疾病治疗上的应用进程以慎而又慎的方式推进着。

 

Refugebio则选择在前人开发成果的基础上利用dCas9的调控性,以模块化功能组合的形式推进自己独特的细胞疗法开发。Refuge梦工厂围绕着巧妙的细胞工程学设计思路而构建。他们将CRISPRi/a系统对细胞活动的短期干预特性,与日趋成熟的CAR-T细胞疗法技术结合。改造后的T细胞保留了经典CAR-T遇敌发动攻击的功能,也装配了dCas与受体的组合结构,从而在遇到特定配体时,可启动CRISPRi/a系统对T细胞内特定基因的激活或抑制作用。

 

在CRISPR技术三雄Editas,Intellia和Crispr公司都尚未正式启动首个人体试验的当下,初创的Refuge团队选择在技术上组合既有和新获得的分子工具,创造性地为下一代的细胞疗法绘出蓝图,不论其能否全然实现工程学上的推理和设想,新的技术革命之门可能将在一批批看似稚嫩的技术雏形背后被打开。到那时,我们今天奉为经典的疗法可能会成为历史上的注脚,而更多的患者将受益于今天尚不能充分想象的技术进步。

 

注释:


【1】Qi, L.S. et al. (2013). Repurposing CRISPR asan RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell152, 1173–1183. 


【2】Gilbert, L.A. et al. (2013). CRISPR-MediatedModular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell 154, 442–451.


【3】Refugebio investor deck



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戴佳凌 • 1年以前
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